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免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理
IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“protein A/G"特異性地結(jié)合到抗體(免疫球蛋白)的FC片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。目前多用proteinA/G預(yù)先結(jié)合在argarosebeads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A/G就能達(dá)到吸附抗原的目的。通過低速離心，可以從含有目的抗原的溶液中將目的抗原與其它抗原分離。
每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)關(guān)鍵步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?
IP實(shí)驗(yàn)步驟
基本實(shí)驗(yàn)步驟
(1)收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)，冰上或者4℃裂解30min，12,000g離心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液將1μg相應(yīng)的抗體和10-50μlproteinA/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；
(3)免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 g速度離心5 min，將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，proteinA/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加樣緩沖液，沸水煮10分鐘；
(4)SDS-PAGE, Western blotting或進(jìn)行質(zhì)譜分析。
一、 樣品處理：免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否，第一步處理樣品非常關(guān)鍵。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)本質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。所以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功非常關(guān)鍵。在這個(gè)環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4°完成外，最為關(guān)鍵的是裂解液的成份。
的和不同的蛋白質(zhì)特性來選擇最佳的裂解液。
a．緩沖液：離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。
b． NaCl濃度一般習(xí)慣用150mM，這主要是因?yàn)?50mM接近生理濃度，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而細(xì)胞內(nèi)部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM，150 mM的NaCl有可能會(huì)破壞這個(gè)區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析
的蛋白的亞細(xì)胞定位而定。
c．甘油由于其粘性，可以對(duì)蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個(gè)很好的保護(hù)作用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。
d．裂解液中的去垢劑可以裂解細(xì)胞質(zhì)膜，也同時(shí)破壞了許多細(xì)胞器的膜，從而釋放了其中儲(chǔ)存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質(zhì)中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復(fù)了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對(duì)于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過ProteaseCocktail(多種蛋白酶抑制劑混合物)可以抑制蛋白酶。
e．去垢劑對(duì)于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)尤其是免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個(gè)因素來影響免疫沉淀效果：-細(xì)胞質(zhì)/器膜的通透性：因?yàn)樵S多目的蛋白都定位在細(xì)胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應(yīng)。
-膜蛋白的釋放：許多膜蛋白的構(gòu)象對(duì)去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對(duì)這類蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，需要謹(jǐn)慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。-蛋白相互作用：不同去垢劑對(duì)不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進(jìn)行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應(yīng)作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準(zhǔn)預(yù)測，所以一個(gè)更為切實(shí)可行的辦法就是通過具體實(shí)驗(yàn)篩選合適的去垢劑種類和濃度。
二、抗體-agarose beads孵育
裂解細(xì)胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲(chǔ)存在-80°保存3個(gè)月，但最好能夠使用新鮮制備的細(xì)胞裂解液上清去進(jìn)行抗體-agarose beads孵育實(shí)驗(yàn)。抗體可以先加入上清中與樣品孵育數(shù)小時(shí)后再加入 Protein A或者G beads孵育過夜，也可以同時(shí)加入抗體和Protein A或者Gbeads孵育過夜。一般選擇1mg總蛋白(1mg/ml)對(duì)應(yīng)添加1ug抗體，最高可以添加至5ug抗體，過多的抗體會(huì)產(chǎn)生假陽性。這個(gè)步驟中關(guān)鍵因素在于選擇合適的陰性對(duì)照。一般選用加同樣量的IgG，但更為妥當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沁x擇針對(duì)胞內(nèi)其它無關(guān)目的蛋白的一抗做對(duì)照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來做陰性對(duì)照，只要確認(rèn)二者之間沒有相互作用；而做胞質(zhì)可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個(gè)可溶性蛋白D來做陰性對(duì)照。同時(shí)，為避免Protein A或者Gbeads有(非)特異性吸附從而造成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預(yù)先將Protein A或者G beads與細(xì)胞裂解液孵育數(shù)小時(shí)，然后取上清用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育。
同時(shí)，Protein A或者G beads對(duì)不同類型的抗體親和力不同，結(jié)合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的ProteinA或者Gbeads也是決定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否的一個(gè)重要因素。一般推薦使用Protein A和Protein G beads的混合物，這樣可以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)效果，而且省去了許多選擇的煩惱。
三、抗體-agarose beads復(fù)合物洗滌：除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對(duì)照外，去除免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非特異性的一個(gè)辦法是對(duì)抗體-agarose beads復(fù)合物進(jìn)行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達(dá)到去除非特異性吸附的效果。例如，針對(duì)單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者雖然是進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度(0.2-0.5%)的SDS洗滌抗體-agarose beads復(fù)合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。
四、鑒定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)用途非常廣泛(見IP： Q&A)，而且基于最基本的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)衍生出了許多免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段(比如免疫共沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的鑒定方法主要視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。我們在本手冊中主要簡單概述常見的免疫沉淀之后?WB檢測需要注意的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。由于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)使用目的蛋白抗體加ProteinA/Gbeads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體-agarosebeads復(fù)合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及ProteinA/Gbeads三者之間是以非共價(jià)健結(jié)合在一起，只有ProteinA/G與agarosebeads是共價(jià)結(jié)合在一起的。因此，最后經(jīng)過添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去 Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣 SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導(dǎo)致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重鏈分子(55KD)和輕鏈分子(25KD)。因此，WB顯色反應(yīng)中除了能檢測到目的蛋白外，如果所使用的二抗與用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體分子屬于同一種屬的話，還能檢測到重鏈和輕鏈分子。通常用于免疫沉淀的抗體量非常大(1ug)，所以當(dāng)目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時(shí)，重鏈或者輕鏈分子的WB信號(hào)常常由于信號(hào)過強(qiáng)而導(dǎo)致影響對(duì)目的蛋白的WB結(jié)果判斷。
a．選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號(hào)。
b．使用交聯(lián)劑將抗體和ProteinA/Gbeads交聯(lián)，然后通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-agarosebeads復(fù)合物，最后離心去除抗體-agarosebeads復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白。
免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì) X的抗體免疫沉淀 X，那么與 X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。
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